Ormgift innehåller enzymer som hydrolyserar karboxylesterbindningar.Substraten för hydrolys är fosfolipider, acetylkolin och aromatiskt acetat.Dessa enzymer inkluderar tre typer: fosfolipas, acetylkolinesteras och aromatiskt esteras.Argininesteras i ormgift kan också hydrolysera syntetiskt arginin eller lysin, men det hydrolyserar främst proteinpeptidbindningar i naturen, så det tillhör proteas.De enzymer som diskuteras här verkar bara på estersubstrat och kan inte verka på någon peptidbindning.Bland dessa enzymer är de biologiska funktionerna av acetylkolinesteras och fosfolipas viktigare och har studerats fullt ut.Vissa ormgifter har stark aromatisk esterasaktivitet, som kan hydrolysera p-nitrofenyletylester, a – eller P-naftalenacetat och indoletylester.Det är fortfarande okänt om denna aktivitet produceras av ett oberoende enzym eller en känd biverkning av karboxyesteras, än mindre dess biologiska betydelse.När giftet från Agkistrodon halys Japonicus reagerades med p-nitrofenyletylester och indoletylester, hittades inte hydrolysat av p-nitrofenol och indolfenol;Tvärtom, om dessa estrar reagerar med cobra Zhoushan-underarten ormgift och Bungarus multicinctus ormgift, kommer de snabbt att hydrolyseras.Det är känt att dessa kobragift har stark kolinesterasaktivitet, som kan vara ansvarig för hydrolys av ovanstående substrat.Faktum är att Mclean et al.(1971) rapporterade att många ormgifter som tillhör Cobra-familjen kan hydrolysera indoletylester, naftalenetylester och butylnaftalenester.Dessa ormgifter kommer från: kobra, svarthalsad kobra, svartläppskobra, gyllene kobra, egyptisk kobra, kungskobra, gyllene kobra mamba, svart mamba och vitläppad mamba (D. aw känner fortfarande östlig rhombola skallerorm
Ormgiftet kan hydrolysera metylindoletylester, som är substratet för att bestämma kolinesterasaktiviteten i serum, men detta ormgift visar inte kolinesterasaktivitet.Detta visar att det finns ett okänt esteras i kobragift, vilket skiljer sig från kolinesteras.För att förstå naturen hos detta enzym behövs ytterligare separationsarbete.
1、 Fosfolipas A2
(I) Översikt
Fosfolipas är ett enzym som kan hydrolysera glycerylfosfat.Det finns 5 sorters fosfolipas i naturen, nämligen fosfolipas A2 och fosfolipas
A., fosfolipas B, fosfolipas C och fosfolipas D. Ormgiftet innehåller huvudsakligen fosfolipas A2 (PLA2), ett fåtal ormgifter innehåller fosfolipas B, och andra fosfolipaser finns främst i djurvävnader och bakterier.Fig. 3-11-4 visar verkansstället för dessa fosfolipaser vid substrathydrolys.
Bland fosfolipaser har PLA2 studerats mer.Det kan vara det mest studerade enzymet i ormgift.Dess substrat är esterbindningen på den andra positionen av Sn-3-glycerofosfat.Detta enzym finns allmänt i ormgift, bigift, skorpiongift och djurvävnader, och PLA2 finns rikligt i fyra familjer ormgift.Eftersom detta enzym bryter röda blodkroppar och orsakar hemolys, kallas det också "hemolysin".Vissa människor kallar också PLA2 hemolytiskt lecitinas.
Ludeeke fann först att ormgift kan producera en hemolytisk förening genom att verka på lecitin genom enzymer.Senare har Delezenne et al.bevisat att när kobragift verkar på hästserum eller äggula, bildar det en hemolytisk substans.Det är nu känt att PLA2 direkt kan verka på fosfolipiderna i erytrocytmembranet, förstöra strukturen av erytrocytmembranet och orsaka direkt hemolys;Det kan också verka på serum eller tillsatt lecitin för att producera hemolytiskt lecitin, som verkar på röda blodkroppar för att producera indirekt hemolys.Även om PLA2 är rikligt i de fyra familjerna av ormgift, är innehållet av enzymer i olika ormgift något annorlunda.Skallerorm (C
Ormgift visade endast svag PLA2-aktivitet.Tabell 3-11-11 illustrerar jämförelsen av PLA2-aktivitet för 10 stora gifter från giftormar i Kina.
Tabell 3-11-11 Jämförelse av fosfolipas VIII-aktiviteter för 10 ormgifter i Kina
Orm gift
Fettsläpp
alifatisk syra,
Cjumol/mg)
Hemolytisk aktivitet CHU50/^ g * ml)
Orm gift
Frigör fettsyror
(^raol/mg)
Hemolytisk aktivitet "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
elva
Micracephal ophis
fem komma ett noll
kalyspallas
8. 68
två tusen åtta hundra
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tre komma åtta två
hundrafyrtio
Bnugarus fasctatus
7,56
tvåhundraåttio
B. multicinctus
en komma nio sex
tvåhundraåttio
Viper a russelli
sju komma noll tre
T, mucrosquamatus
en komma åtta fem
Siamensis
T. stejnegeri
0, 97
（2） Separation och rening
Innehållet av PLA2 i ormgift är stort, och det är stabilt mot värme, syra, alkali och denatureringsmedel, så att det är lätt att rena och separera PLA2.Den vanliga metoden är att först utföra gelfiltrering på det råa giftet, sedan utföra jonbyteskromatografi och nästa steg kan upprepas.Det bör noteras att frystorkning av PLA2 efter jonbyteskromatografi inte bör orsaka aggregation, eftersom frystorkningsprocessen ofta ökar jonstyrkan i systemet, vilket är en viktig faktor som orsakar aggregation av PLA2.Förutom ovanstående allmänna metoder har följande metoder också antagits: ① Wells et al.② Substratanalogen av PLA2 användes som ligand för affinitetskromatografi.Denna ligand kan binda till PLA2 i ormgift med Ca2+.EDTA används mest som eluent.Efter att Ca2+ har tagits bort minskar affiniteten mellan PLA2 och ligand, och den kan dissocieras från ligand.Andra använder 30% organisk lösning eller 6mol/L urea som elueringsmedel.③ Hydrofob kromatografi utfördes med PheiiylSephar0SeCL-4B för att avlägsna spår av PLA2 i kardiotoxin.④ Anti-PLA2-antikropp användes som ligand för att utföra affinitetskromatografi på PLA2.
Hittills har ett stort antal ormgift PLAZ renats.Tu et al.(1977) listade PLA2 renat från ormgift före 1975. Under de senaste åren har ett stort antal artiklar om separation och rening av PLA2 rapporterats varje år.Här fokuserar vi på separation och rening av PLA av kinesiska forskare.
Chen Yuancong et al.(1981) separerade tre PLA2-arter från giftet från Agkistrodon halys Pallas i Zhejiang, som kan delas in i surt, neutralt och alkaliskt PLA2 enligt deras isoelektriska punkter.Enligt dess toxicitet är neutral PLA2 mer giftig, vilket har identifierats som presynaptiskt neurotoxin Agkistrodotoxin.Alkaliskt PLA2 är mindre giftigt, och surt PLA2 har nästan ingen toxicitet.Wu Xiangfu et al.(1984) jämförde egenskaperna hos tre PLA2, inklusive molekylvikt, aminosyrasammansättning, N-terminal, isoelektrisk punkt, termisk stabilitet, enzymaktivitet, toxicitet och hemolytisk aktivitet.Resultaten visade att de hade liknande molekylvikt och termisk stabilitet, men hade signifikanta skillnader i andra aspekter.När det gäller enzymaktivitet var sur enzymaktivitet högre än alkalisk enzymaktivitet;Den hemolytiska effekten av alkaliskt enzym på röda blodkroppar från råtta var starkast, följt av neutralt enzym och surt enzym som knappast hemolyserades.Därför spekuleras det att den hemolytiska effekten av PLAZ är relaterad till laddningen av PLA2-molekylen.Zhang Jingkang et al.(1981) har gjort Agkistrodotoxinkristaller.Tu Guangliang et al.(1983) rapporterade att en giftig PLA med en isoelektrisk punkt på 7,6 isolerades och renades från giftet från Vipera rotundus från Fujian, och dess fysikaliska och kemiska egenskaper, aminosyrasammansättning och sekvensen av 22 aminosyrarester vid N. -terminal bestämdes.Li Yuesheng et al.(1985) isolerade och renade en annan PLA2 från giftet från Viper rotundus i Fujian.Subenheten för PLA2 * är 13 800, den isoelektriska punkten är 10,4 och den specifika aktiviteten är 35/xnioI/miri mg。 Med lecitin som substrat är enzymets optimala pH 8,0 och den optimala temperaturen är 65 °C LD5 injiceras intravenöst i möss.Det är 0,5 ± 0,12 mg/kg.Detta enzym har uppenbara antikoagulerande och hemolytiska effekter.Den giftiga PLA2-molekylen består av 123 rester av 18 sorters aminosyror.Molekylen är rik på cystein (14), asparaginsyra (14) och glycin (12), men innehåller bara en metionin, och dess N-terminal är serinrest.Jämfört med PLA2 isolerad av Tuguang är molekylvikten och antalet aminosyrarester för de två isoenzymerna mycket lika, och aminosyrasammansättningen är också mycket lika, men antalet asparaginsyra- och prolinrester är något annorlunda.Guangxi king cobra ormgift innehåller rik PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) isolerade en PLA2 från giftet, som har en specifik aktivitet 3,6 gånger högre än det ursprungliga giftet, en molekylvikt på 13000, en sammansättning av 122 aminosyrarester, en isoelektrisk punkt på 8,9 och god termisk stabilitet.Från elektronmikroskopobservation av effekten av grundläggande PLA2 på röda blodkroppar, kan det ses att det har uppenbar effekt på mänskliga röda blodkroppars membran, men har ingen uppenbar effekt på getens röda blodkroppar.Denna PLA2 har uppenbar retardationseffekt på den elektroforetiska hastigheten hos röda blodkroppar hos människor, getter, kaniner och marsvin.Chen et al.Detta enzym kan hämma trombocytaggregation inducerad av ADP, kollagen och natriumarachidonsyra.När PLA2-koncentrationen är 10/xg/ml~lOOjug/ml, hämmas trombocytaggregationen fullständigt.Om tvättade blodplättar användes som material kunde PLA2 inte hämma aggregation vid koncentrationen 20 mg/ml.Aspirin är en hämmare av cyklooxygenas, som kan hämma effekten av PLA2 på blodplättar.PLA2 kan hämma trombocytaggregation genom att hydrolysera arakidonsyra för att syntetisera tromboxan A2.Lösningskonformationen av PLA2 producerad av Agkistrodon halys Pallas gift i Zhejiang-provinsen studerades med hjälp av cirkulär dikroism, fluorescens och UV-absorption.De experimentella resultaten visade att huvudkedjekonformationen för detta enzym liknade den för samma sorts enzym från andra arter och släkten, skelettets konformation hade god värmebeständighet och den strukturella förändringen i sur miljö var reversibel.Kombinationen av aktivator Ca2+ och enzym påverkar inte miljön av tryptofanrester, medan hämmaren Zn2+ gör tvärtom.Det sätt på vilket pH-värdet i lösningen påverkar enzymaktiviteten skiljer sig från ovanstående reagens.
I processen med PLA2-rening av ormgift är ett uppenbart fenomen att ett ormgift innehåller två eller flera PLA2-elueringstoppar.Detta fenomen kan förklaras enligt följande: ① på grund av förekomsten av isozymer;② En typ av PLA2 polymeriseras till en mängd olika PLA2-blandningar med olika molekylvikter, varav de flesta är i intervallet 9 000~40 000;③ Kombinationen av PLA2 och andra ormgiftkomponenter komplicerar PLA2;④ Eftersom amidbindningen i PLA2 hydrolyseras ändras laddningen.① Och ② är vanliga, med bara några få undantag, såsom PLA2 i CrWa/w ormgift
Det finns två situationer: ① och ②.Det tredje tillståndet har hittats i PLA2 i giftet från följande ormar: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestinsk huggorm, sandhuggorm och fruktansvärd skallerorm km.
Resultatet av fall ④ gör att migrationshastigheten för PLA2 förändras under elektrofores, men aminosyrasammansättningen ändras inte.Peptider kan brytas genom hydrolys, men i allmänhet är de fortfarande bundna med disulfidbindningar.Giftet från den östra gropskallerormen innehåller två former av PLA2, som kallas typ a respektive typ p PLA2.Skillnaden mellan dessa två typer av PLA2 är bara en aminosyra, det vill säga glutamin i en PLA2-molekyl ersätts av glutaminsyra i den andra PLA2-molekylen.Även om den exakta orsaken till denna skillnad inte är klar, tror man allmänt att den är relaterad till deamineringen av PLA2.Om PLA2 i det palestinska huggormsgiftet hålls varmt med det råa giftet kommer ändgrupperna i dess enzymmolekyler att bli fler än tidigare.Från C PLA2 isolerad från ormgift har två olika N-terminaler och dess molekylvikt är 30 000. Detta fenomen kan orsakas av den asymmetriska dimeren av PLA2, som liknar den symmetriska dimeren som bildas av PLA2 i giftet från östlig diamantryggsskallerorm och western diamondback skallerorm.Den asiatiska kobran består av många underarter, av vilka några inte är särskilt bestämda i klassificeringen.Till exempel är det som tidigare kallades Cobras yttre kaspiska underart nu erkänt
Det bör tillskrivas den yttre Kaspiska havets kobra.Eftersom det finns många underarter och de blandas ihop varierar sammansättningen av ormgift mycket på grund av olika källor, och halten av PLA2-isozymer är också hög.Till exempel kobragift
Minst 9 sorters PLA2-isozymer av r^ll-arter hittades i, och 7 sorters PLA2-isozymer hittades i giftet från kobra-underarten Caspian.Durkin et al.(1981) studerade PLA2-innehållet och antalet isozymer i olika ormgift, inklusive 18 kobragift, 3 mambagift, 5 huggormgift, 16 skallerormsgift och 3 havsormgift.I allmänhet är PLA2-aktiviteten hos kobragift hög, med många isozymer.PLA2-aktiviteten och isozymerna av huggormsgift är medelhöga.PLA2-aktiviteten hos mambagift och skallerormsgift är mycket låg eller ingen PLA2-aktivitet.PLA2-aktiviteten hos havsormsgift är också låg.
Under de senaste åren har det inte rapporterats att PLA2 i ormgift existerar i form av aktiv dimer, såsom den östra rhombophora skallerormen (C. ormgift innehåller typ a och typ P PLA2, som båda är sammansatta av två identiska underenheter , och endast dimerase har
Aktivitet.Shen et al.föreslog också att endast dimeren av PLA2 av ormgiftet är den aktiva formen av enzymet.Studiet av rumslig struktur bevisar också att PLA2 från western diamantryggskallerorm finns i form av dimer.Fiskätande förening
Det finns två olika PLA ^ Ei och E2 av ormgift, där 仏 finns i form av dimer, dimeren är aktiv och dess dissocierade monomer är inaktiv.Lu Yinghua et al.(1980) studerade vidare de fysikaliska och kemiska egenskaperna och reaktionskinetiken hos E. Jayanthi et al.(1989) isolerade en basisk PLA2 (VRVPL-V) från huggormsgiftet.Molekylvikten för monomeren PLA2 är 10 000, vilket har dödliga, antikoagulerande och ödemeffekter.Enzymet kan polymerisera polymerer med olika molekylvikter under tillståndet PH 4,8, och polymerisationsgraden och molekylvikten hos polymerer ökar med temperaturökningen.Molekylvikten för polymeren som genereras vid 96 ° C är 53 100, och PLA2-aktiviteten för denna polymer ökar med två
Posttid: 2022-nov-18